同步辐射显微断层成像监测口腔骨植入材料置入体内后的生物相容性及定量分析：随机对照动物实验方案

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.023

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
同步辐射显微断层成像技术(SR-μCT)：是基于同步辐射光源的X射线相位衬度成像技术(XPCI)与断层成像技术(CT)的完美结合。因SR-μCT的极高相位衬度分辨率，能分辨软组织内极细微的结构变化，极适宜于软组织成像；而其另一个大优点是极高的空间分辨率，达到了微米级甚至亚微米级(最高可达约0.3 μm)，能实现对细胞的成像。SR-μCT可以在不用切片、染色的情况下，实现对组织内部细微结构的真实再现，这几个特点使同步辐射成像技术在医学、生物学、材料科学等领域具有重要的研究价值和应用前景。
口腔骨移植：创伤、肿瘤、感染、功能性萎缩、先天性疾病以及牙周炎等原因均能造成口腔内骨组织缺失，而目前骨缺损修复的主要方式是植骨或增加骨量即在缺损区充填骨替代材料。

背景：目前骨缺损修复的主要方式是在缺损区充填骨替代材料，为了解骨缺损修复效果，需深入了解骨替代材料植入后骨缺损微细结构改变。同步辐射显微断层成像技术(SR-μCT)可以在不用切片、染色的情况下，进行高衬度分辨率、高空间分辨率的显微三维成像，有极高的科研及临床应用价值。
目的：探讨在口腔医学检查中应用SR-μCT对骨结合微米级检查的可行性。
方法：实验为随机对照动物实验，在中国天津，天津市第五中心医院完成。取24只雄性新西兰大白兔制备下颌骨缺损模型，随机分为4组，分别在缺损区植入自体骨、Bio-oss骨粉、β-磷酸三钙骨粉，阴性对照组不植入任何材料。术后2，4，8周取材(包括缺损区及周围部分正常骨组织)，行SR-μCT检查，之后制成组织切片行组织病理学检查，从多角度观察不同种类骨移植材料的骨修复情况。实验方案经天津市第五中心医院伦理委员会批准。新西兰大白兔的实验操作和取材遵循《关于善待实验动物的指导性意见》规定，并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。
结果与结论：实验证实了SR-μCT能在不破坏样品的情况下，完成对骨结合及新生骨微观的观察，得到骨体积、骨小梁数目及骨密度等的更准确的定量数据。因此，通过SR-μCT能全面分析骨植入材料置入体内后的生物相容性反应，深入了解不同种类骨移植材料在骨缺损处微米级结构改变，可为提高骨缺损愈合的效果提供实验依据。

ORCID: 0000-0002-2264-3352(孙莲莲)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 同步辐射显微断层成像, Bio-oss骨粉, β-磷酸三钙, 自体骨, 骨缺损, 微观结构, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: At present, bone substitute filling is mainly used for bone defect repair. In order to understand the effect on bone defect repair, it is necessary to look into the microstructure changes of bone defects after bone substitute implantation. Synchrotron radiation-based micro-computed-tomography (SR-μCT) can be used to make high-resolution, high-resolution three-dimensional imaging without slicing and dyeing, and has high scientific and clinical value.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of SR-μCT in micron-level bone osseointegration examination in oral medicine.
METHODS: This randomized controlled animal experiment was completed at the Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin, China. A rabbit model of mandibular defect was made in 24 male New Zealand white rabbits. The model rats were randomly divided into four groups and received autologous bone, Bio-oss bone meal, β-tricalcium phosphate powder and no implantation (negative control group) in the defective area, respectively. Bone samples, including the defect area and the surrounding normal bone tissue, were taken at 2, 4, 8 weeks postoperatively for SR-μCT examination, followed by histopathological examination, in order to observe the repairing effects of different types of bone implant materials from different angles. The study protocol has been approved by the Ethics Committee of the Fifth Central Hespital of Tianjin in China. The study procedures were completed in accordance with the Guidance Suggestions for the Care and Use of Experimental Animals of China and the guidelines of the National Institutes of Health, USA.
RESULTS AND CONCLUSION: In this study, SR-μCT could be used to observe the bone microstructure and osseointegration with no damage to samples to collect accurate quantitative data, including bone volume, number of bone trabeculae and bone mineral density. Therefore, SR-μCT can fully analyze the biocompatibility of bone implant material in vivo, give insight into the micron-level changes of different types of bone implant materials in the bone defect, thereby providing experimental evidence to improve bone defect healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tomography, X-Ray Computed, Bone Substitutes, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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Sun Lian-lian, Wang Zhi-xing. Biocompatibility and quantitative analysis of oral bone implant materials in vivo using synchrotron radiation-based micro-computed-tomography: study protocol for a
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引言

创伤、肿瘤、感染、功能性萎缩、先天性疾病以及牙周炎等原因均能造成口腔内骨组织缺失，而目前骨缺损修复的主要方式是植骨或增加骨量即在缺损区充填骨替代材料^[1-9]。理想的骨替代材料应该是与组织相容、无毒性、成骨效应佳，同时与骨组织之间能早期形成骨性结合界面，并能适时降解而最终被自体骨组织完全替代。因此，必须全面分析骨植入材料植入体内后的生物反应，更加深入了解材料在骨缺损微细结构改变，以便为提高骨缺损愈合的效果提供实验依据。

同步辐射显微断层成像技术(synchrotron radiation- based micro-computed-tomography，SR-μCT)是近年来国内外生物医学领域成像研究的热点，具有高亮度、高准直性、高相干性等特点^[^10-11^]。因SR-μCT的极高相位衬度分辨率，能分辨软组织内极细微的结构变化，极适宜于软组织成像；而其另一个大优点是极高的空间分辨率，达到了微米级甚至亚微米级(最高可达约0.3 μm，本研究采用的10倍探头分辨率为0.74 μm)，能实现对细胞的成像^[^12-15^]。SR-μCT可以在不用切片、染色的情况下，实现对组织内部细微结构的真实再现，这几个特点使同步辐射成像技术在医学、生物学、材料科学等领域具有重要的研究价值和应用前景。

目前国内同步辐射成像技术多应用在微血管成像中，比如曹勇^[1⁶^]将SR-μCT应用于大鼠脊髓微血管三维网络成像，以获取血管形态计量学参数(包括血管数目、面积、面积百分比、容积和容积百分比)，并与传统的Micro-CT进行比较，结果显示SR-μCT获取的血管形态计量学参数均高于Micro-CT，差异有显著性意义(P < 0.05)；张萌琦^[1⁷^]则建立了基于同步辐射的脑微血管可视化体系，进行了大鼠缺血性脑卒中微血管网络重塑的同步辐射三维成像实验，证实了SR-μCT可提供血管新生动态发展的影像学证据；李蓓蕾^[1⁸^]应用同步辐射技术成功检测肝细胞癌新生血管，验证了同步辐射相衬成像可同时从3D和2D角度，提供血管新生动态发展的影像学证据。也有研究者将SR-μCT用于评估骨腱连接点结构，证实SR-μCT可对兔髌骨-髌腱连接点进行高分辨率显微成像，是一种评估骨腱连接点的三维形态学特点的新方法^[1⁹^]。目前还未见将SR-μCT用于口腔口腔医学骨缺损愈合检查中的报道。

本研究采用SR-μCT对兔下颌骨骨缺损及邻近区域进行影像学分析，通过相关参数评估自体骨、Bio-Oss骨粉及β-磷酸三钙骨粉对兔下颌骨缺损愈合的影响，观察不同种类骨移植材料与骨组织的结合情况，验证SR-μCT对骨结合微米级检查的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 实验设计随机对照动物实验。建立骨缺损新西兰兔模型，分别植入自体骨、Bio-oss骨粉、β-磷酸三钙骨粉不同种类骨移植材料，应用SR-μCT影像学和组织病理观测不同时期植入材料与骨组织的愈合情况。

1.2 实验完成地点中国天津，天津市第五中心医院。SR-μCT在中科院上海应用物理研究院上海光源X射线成像及生物医学应用光束线站完成，完成时间为2017年1至6月。

1.3 研究目的

(1)全面分析骨植入材料植入体内后的生物相容性反应，深入了解不同种类骨移植材料在骨缺损微米级结构改变，为提高骨缺损愈合的效果提供实验依据。

(2)在不破坏样品的情况下，对骨骼等进行高分辨率X射线成像，获取样品内部详尽的三维结构信息，通过SR-μCT对骨结合及新生骨微观的观察，评估骨体积(BV/TV)，骨小梁数目(Tb.N)，骨密度(BMD)的情况。

(3)通过动物实验进行SR-μCT影像学和组织病理检查对比研究，探讨在不进行有创检查的情况下观察骨结合的微米级情况的可行性。

1.4 动物的选择选择普通级健康成年新西兰兔24只，雄性，体质量2.0-2.5 kg，由天津市国际生物医药联合研究院动物实验中心提供。所有动物均无术区创伤、感染及其他全身疾病。

执行《实验动物管理条例》和《实验动物许可管理办法》规定进行实验。

1.5 实验方法

1.5.1 动物模型制备 24只雄性新西兰大白兔均制备下颌骨缺损模型。所有兔测量体质量，以速眠新0.1 mL/kg肌肉注射，3%戊巴比妥钠0.3 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，待全身麻醉生效后，将大白兔固定于专用手术台，保持动物的呼吸道通畅。麻醉后取侧卧位固定，采用四肢加头部固定方法，下颌部术区备皮，常规碘伏及体积分数75%乙醇消毒。于术区皮下注射20 mg/L利多卡因2 mL，采用颌下切口，切开皮肤、皮下组织，分离部分咬肌肌纤维，仔细剥离附着组织及骨膜后，暴露下颌角前缘后牙区下颌骨体部外侧面。选择该区为缺损制备区，在滴水降温环境下，于下颌骨体部外侧面用骨钻制备出大小为15 mm×8 mm的洞穿型骨膜骨质缺损。

1.5.2 分组处理将24只兔随机分为4组，自体骨组、Bio-oss骨粉组、β-磷酸三钙骨粉组及阴性对照组，每组6只兔。

自体骨组、Bio-oss骨粉组、β-磷酸三钙骨粉组在用骨钻制备洞穿型骨膜骨质缺损后，用无菌生理盐水冲洗创面，于缺损底部平铺一层骨粉(分别为取自自体髂骨的自体骨；Bio-oss骨粉；β-磷酸三钙骨粉)，使植入面与周围骨面平齐，表面使用海奥口腔修复膜；阴性对照组制备骨缺损后不植入任何材料。手术结束后分层缝合肌肉，皮下组织及皮肤。

待动物苏醒后放回笼中，以相同条件常规饲养，术后 3 d每只兔以青霉素80×10⁴ U肌注预防感染，同时每日清洁创口，术后7 d 拆线。

1.5.3 观察指标分别于材料植入后2，4，8周每组处死2只动物，获取标本，行大体观察、影像学观察，送样到中科院上海应用物理研究院上海光源X射线成像及生物医学应用光束线站进行SR-μCT检查。之后再经乙醇梯度脱水、浸蜡、包埋、切片后标本制成合适厚度组织切片行组织病理学检查，从多角度观察不同种类骨移植材料的骨修复的情况。

新生骨定量分析：取术后2，4，8周的兔下颌骨骨缺损模型标本(包括缺损区及周围部分正常骨组织)置于SR-μCT 系统的测试管内，固定稳固，对样品行扫描， SR-μCT分析软件进行数据分析，分析术后2，4，8周新生骨质的生长及骨缺损的修复情况。评估指标包括骨体积、骨小梁数目和骨密度。

组织学观察：动物处死后，切取缺损处组织及临近骨组织及新生骨组织制作标本，在SR-μCT的影像学检查之后用5%硝酸脱钙，进行组织学标本的制作，苏木精-伊红染色，观察标本的组织病理学变化。

1.6 研究设计

1.6.1 研究设计概要随机分组干预，动物体内实验。

1.6.2 实验计划实验计划解决3个问题：

(1)系统观察骨缺损动物模型中，自体骨、Bio-oss骨粉及β-磷酸三钙骨粉3种骨移植材料植入后的骨组织愈合情况；

(2)通过SR-μCT对骨结合及新生骨进行微观的观察，验证SR-μCT对骨结合微米级检查的可行性；

(3)对比应用SR-μCT影像学和组织病理检查两种检查方法探查骨缺损处新生骨组织骨密度、骨小梁骨微结构的异同点。

1.6.3 实验步骤

(1)科研实验动物的饲养及移植骨植入术前的准备工作；

(2)进行Bio-oss骨粉、β-磷酸三钙骨粉骨移植手术，以及术后动物取材并进行同步辐射显微断层成像检查；

(3)自体骨移植和阴性对照组动物的手术及术后标本制作，再行同步辐射显微断层成像检查；

(4)将进行SR-μCT成像后的标本给予组织病理学检查，并进行二者的比对性研究；

(5)根据SR-μCT对骨结合及新生骨微观的观察的评估骨体积、骨小梁数目、骨密度；

(6)根据上述实验结果进行数据分析，撰写论文。

1.6.3 技术路线图见图1。

1.7 指标与观察

1.7.1 主要观察指标 SR-μCT对新生骨定量分析，评估指标骨体积、骨小梁数目及骨密度。

1.7.2 次要观察指标 ①组织病理检查；②SR-μCT影像学和组织病理检查结果的对比。

1.7.3 实验观察指标一览表见表1。

1.8 统计学分析所有假设检验均为双侧检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

应用SPSS 17.0统计软件完成数据统计分析，计量资料用x(_)±s表示，采用方差分析；计数资料采用χ²检验。统计分析由不参与实验的专业统计人员完成。在所有数据录入、审核完毕后，统计人员应及时完成统计分析工作，交付实验的主要研究者，写出研究报告。

1.9 数据管理及质量保证 ①实验结果数据表格由研究者制作，实验中需认真填写数据记录表，记录过程不遗漏项目，应经常核对；②监察员定期确认所有的数据记录正确完整，与原始记录一致；③由2个数据录入员负责抄录实验结果，分别将抄录后的文档标注日期上传至指定的电脑备份。

数据的保密：实验数据包括书面数据和电子版数据2种形式，电子版数据由研究者核对并对数据库进行锁定，锁定后的数据文件不允许再作变动并将数据库保存备查，任何非授权内研究者外的人员均不得接触。书面数据存放于固定地点并加锁，钥匙由资料管理员和研究室负责人保管。

1.10 伦理批准实验方案经天津市第五中心医院伦理委员会批准。新西兰大白兔的实验操作和取材遵循《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。

2 实验目前状态 Trial status

实验已经完成实验动物的购买及饲养；正在进行骨移植材料的招标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程